Molekuláris biológiai vizsgálatok a kutyatenyésztők és kutyatartók szolgálatában

 

1. Kutya genetikai azonosítás -DNS „ujjlenyomat”, apasági vizsgálat

2. Kullancs vizsgálatok- Lyme, Babesia


1. Kutya genetikai azonosítás -DNS „ujjlenyomat”, apasági vizsgálat

 A kutyák genetikai azonosítása -molekuláris biológiai módszerekkel- számos területen nyújt segítséget kutyatartók, tenyésztők és fajtaklubok számára. Miután minden kutya egyedi genetikai állománnyal rendelkezik, még alomtestvérek között sem fordulhat elő két, genetikailag teljesen azonos egyed. Éppen ezért a DNS „ujjlenyomattal” minden egyed élete végéig beazonosítható és összehasonlítható más egyedekkel. Az AKC által elismert módszer, mely a genetikai állományon/DNS-en belül tíz speciálisan kiválasztott DNS szakaszt (mikroszatellitát) vizsgál, melyek hosszbeli változékonysága annyira nagyszámú, hogy megfelelő alapot ad az egyedek megkülönböztethetőséghez. Ezáltal segítséget nyújthat kérdéses helyzetekben egy-egy kutya azonosságának igazolásához, apasági vizsgálatként- nem megtervezett szaporulat beazonosításához, azaz lehetséges apaállat kiszűréséhez, egy állomány feltérképezéséhez, beltenyésztés elkerüléséhez. A DNS mintázat elkészítését követően újabb mintavétel nélkül, sőt az állat halála után is összehasonlítható más egyedekkel, beazonosíthatóak az utódok.


A Kutya genetikai azonosítás molekuláris biológiai alapjai

Az ember 46, míg a kutyák 78 kromoszómával rendelkeznek, melyeket DNS-fehérje komplexek építenek fel és a sejtmagban helyezkednek el. A DNS lánc négyféle építőegységből, ún. nucleotid-ból áll: A, T, G, C és ezek egymás utáni sorrendje kombinálódik olyan módon, hogy meghatároznak kódoló/működő géneket és nemkódoló szakaszokat. Az örökítőanyagban, a DNS-ben vannak olyan kis méretű ismétlődő szekvenciák, amelyek a működő géneken kívüli, fehérjévé át nem íródó – ún. nemkódoló DNS szakaszokon helyezkednek el, ezeket nevezzük mikroszatellitáknak. Ezek azok a rövid szakaszok, melyek az egyedre jellemző meghatározott számú és meghatározott ismétlődésű bázispárból állnak. Lehetnek egy, kettő, három vagy négy bázispárból állóak, mely szerint mono-, di-, tri-, vagy tetra-nucleotid repeat-nek nevezik őket (pl. CACA, ATGCATGC). Ezek a rövid szakaszok ismétlődhetnek 5-30-szor is egymás után.

A kutyák esetében eddig mintegy 400 mikroszatellitát fedeztek fel, melyek különböző kromoszómák különböző régióiban helyezkednek el elszórtan a kutya genomban. Minden egyes egyed minden mikroszatellitából két példányt hordoz, egyet az anyaállattól, egyet az apaállattól örökölve. Ezek ismétlődési száma többnyire nem egyforma, éppen ezért egyértelműen nyomonkövethető, hogy melyik szakasz melyik állattól származik. A genetikai azonosításhoz és származási vizsgálatokhoz olyan, jól megválasztott mikroszatellitákat használnak, amelyek heterogenitása megfelelően nagy az egyedi DNS „ujjlenyomat” elkészítéséhez, így még beltenyésztett fajták esetében is megbízható eredményt adnak.


                                      


A kutya genetikai vizsgálatok mintavétellel kezdődnek, amelyhez különféle módszerek léteznek. Egy-egy vizsgálathoz szükség van DNS mintára az anyaállattól, a kölyköktől és a feltételezett apaállatoktól. Leggyakrabban vérből történik a DNS izolálás, de létezik olyan módszer is amely által egy egyszerűbb mintavétellel, akár a kutya gazdája, állatorvosi segítség nélkül is képes mintát venni állatából. Ezzel az eljárással steril mintavevő tupferrel vett nyálkahártya kaparék mintából történik a DNS izolálás.
A mikroszatellitákat kétoldalról közrefogó szekvenciák konzervatívak, azaz nem változó génszakaszok, éppen ezért egy speciális, de a molekuláris biológiában általánosan használt PCR (polimeráz láncreakció) technikával egyértelműen vizsgálhatóak. A módszer lényege, hogy a kutya nyálkahártya kaparék mintából laboratóriumi körülmények között izolált DNS-ből, speciális körülmények között külön-külön történik a kiválasztott mikroszatellita szakaszok megsokszorozása, azért, hogy a mennyiségük a detektálhatósági szintet elérje. Mindezt úgy történik, hogy különböző fluoreszcens festékkel jelölődnek, mely az egyedi detektálásukat segíti egy speciális kapilláris gélelektroforézis rendszerben, amely méret szerint elválasztja a DNS szakaszokat. Ez a rendszer lehetővé teszi azt, hogy teljesen pontosan kimutatható legyen egy-egy mikroszatellita szakaszról, hogy hány nukleotidból épül fel. Az ismert méretű mikroszatellita szakaszok összessége adja a minden egyedre speciálisan jellemző DNS „ujjlenyomatot”.

    
 

    Teljes bizonyossággal és 100 %-ban semmilyen vizsgálattal nem állapítható az meg, hogy mely egyednek melyik az őse. A kutya apasági vizsgálatokhoz felhasználva ezt a módszert egészen pontosan azt lehetséges kimutatni, hogy melyik kan biztosan nem lehet egy vizsgált kölyök apja, tehát kizárásos alapon állapítható meg a feltételezett apaság. A mikroszatellita szakaszok hosszának változékonysága és a molekuláris biológiai módszerek specificitása azonban biztos alapot adnak a pontos diagnózis felállítására.



2. Kullancs vizsgálatok -Lyme-kór, Babesiosis

Hazánkban a klímaváltozás és különféle egyéb tényezők következtében felszaporodott kullancsok óriási veszélyt jelentenek ránk és állatainkra nézve is. A kullancsok kártétele kettős: egyrészt vért szívnak, de ennél lényegesen veszélyesebb, hogy egyre gyakrabban a vérszívásukkal párhuzamosan különféle betegségeket okozó vírusokat, baktériumokat, egysejtűeket juttatnak be a megtámadott szervezetbe. A kullancsok napjainkban már szinte mindenhol jelen vannak. Kutyáknál a két legsúlyosabb kullancsok által terjesztett betegség a Borreliák által okozott Lyme-kór és a Babesiosis.

A Lyme-kór az embert is megbetegíti, de a kutyák, tartásmódjukból adódóan még inkább veszélyeztetettek. Emberre elsősorban a fertőzött kullancsok csípése jelent veszélyt, de előfordulhat megbetegedés a fertőzött kutya vizelete révén is. Egyes felmérések szerint ma Magyarországon a Lyme-kórt okozó Borrelia baktérium minden 10. kullancsban jelen van. Kutyáknál a betegség diagnosztizálása a jellegtelen, változatos és összetett klinikai tünetei miatt meglehetősen nehéz, ezért jelenleg ritkán kerül felismerésre. A fertőzött kullancs okozta csípés helyén egyes esetekben kialakul bőrpír, míg más esetekben nem, de ez a szőrzet miatt egyébként is ritkán észrevehető. A tünetek hetekkel vagy akár hónapokkal a fertőződést követően jelentkeznek. A Lyme-kór egy idült jellegű, több szervrendszert érintő betegség. A fertőző kullancs szúrását követő néhány hét, hónap elteltével a belázasodó kutya általános tüneteket mutat: kedvetlenség, étvágytalanság, bágyadtság, gyengeség, krónikus ízületgyulladás, testszerte nyirokcsomó megnagyobbodás, szőrhullás. Néhány hét múlva a tünetek enyhülnek vagy elmúlnak, esetenként azonban hetek, hónapok alatt idült sokízületi gyulladás alakul ki, a kutya sántít, nehezen, nem szívesen mozog. Előfordulnak vese- és szívelváltozások, ideggyulladások, bénulások is. A beteg állatok több hétig tartó antibiotikum-kúrával gyógyíthatók, abban az esetben ha a betegséget korán felismerték, és a kezelést azonnal megkezdték. Elhanyagolt esetekben a betegség idültté válik és akár halállal is végződhet.

A babesiosis egyre gyakrabban előforduló súlyos vérszegénységgel járó megbetegedés kutyákban, amely gyors állatorvosi beavatkozás hiányában végzetes is lehet. A betegséget a Babesia canis nevű egysejtű élőlény okozza, mely a vérben élősködik és a vörösvértestek szétesését okozza. A fertőzött állatban a tünetek pár nap –néhány hét múlva jelentkeznek. A betegség kimenetele igen változatos lehet. Gyógykezelés hiányában, az állat 1 hét alatt elpusztulhat, de az időben észrevett betegség akár egy hét alatt gyógyítható is. Leggyakoribb a heveny forma, ami nagyon jellegzetes tünetekkel jár: nagyon magas láz, nyugtalanság, bágyadtság, étvágytalanság, kiszáradás és rohamos lesoványodás, vérfesték vizelés miatt sötétbarna vizelet, de ez gyakran csak a betegség kezdetén mutatkozik, sőt az idült, elhúzódó esetekben hiányozhat is. Előfordulhatnak idegrendszeri tünetek is: ingadozó járás, a végtagok gyengesége, bénulása.

A molekuláris biológiai módszerekkel lehetőség nyílik magából a kutyából eltávolított kullancsból történő kórokozó kimutatására. Ezáltal a tünetek kialakulása előtt pontos képet kaphatunk arról, hogy az állat potenciálisan megfertőződhet-e az adott kullancs által hordozott valamelyik kórokozótól. A molekuláris biológiai vizsgálat lényege az egyes kórokozók genetikai állományára tervezett speciális kis kezdő-szekvenciák, oligonukleotid primerek segítségével kizárólag az adott kórokozó egy jellemző génszakaszának megsokszorozása az ún. PCR technika segítségével. A módszer kiindulásként, templátként a kullancsból származó DNS-eket használja fel, ezáltal a vizsgálat során kizárólag az adott kórokozót hordozó kullancs esetében detektálható a jellemző DNS szakasz. Az adott kórokozót nem hordozó kullancsnál nincs mintaként jelen lévő DNS, amit a vizsgálat kimutatna, ilyenkor az eredmény negatív.
Legfontosabb természetesen a megelőzés illetve ha már bekövetkezett a kullancs bőbe fúródása -annak mielőbbi szakszerű eltávolítása. Nagyon fontos a kutyákban talált kullancs megőrzése és laboratóriumi vizsgálata. Pozitív eredmény nem jelenti egyértelműen a megfertőződést, de mindenképpen indokolttá tesz egy vérvizsgálatot, így az idejében észrevett fertőzés esetén azonnal elkezdődhet a gyógykezelés.

                            Dr Józsa Rita

A vizsgálatokról bővebben tájékozódhat: DRC Kft. Molekuláris Biológiai Laboratórium, Balatonfüred, Ezt a címet a spamrobotok ellen védjük. Engedélyezd a Javascript használatát, hogy megtekinthesd. , 06-87/580-221.